Transformasi Bakteri – Catatan Sains

0


Transformasi bakteri adalah proses transfer materi genetik asing dari lingkungan eksternal melalui membran sel.

Ini adalah sebuah mode transfer gen horizontal yang pertama kali dilaporkan oleh ahli bakteriologi Inggris Frederick Griffith pada tahun Streptococcus pneumoniae pada tahun 1928. Dia menentukan apakah bakteri yang dibunuh dengan panas dapat digunakan untuk memvaksinasi tikus terhadap pneumonia atau tidak dan melakukan percobaan yang menghasilkan strain non-virulen dari Streptococcus pneumoniae dapat dibuat virulen dengan memaparkan strain virulen yang dimatikan dengan panas. Dari eksperimen ini, ia menghipotesiskan prinsip transformasi bahwa galur yang dibunuh dengan panas bertanggung jawab untuk membuat galur yang tidak berbahaya menjadi virulen. Pada tahun 1970, Morton Mandel dan Akiko Higo juga menemukan bahwa E. coli dibawa untuk mengambil DNA dari bakteriofag.

Proses transfer gen dalam transformasi membutuhkan DNA yang persisten di sekitarnya meskipun sel donor tidak hidup. DNA di lingkungan dilepaskan oleh beberapa genera bakteri yang telah mengalami kondisi lingkungan yang ekstrim dan keras. Tujuan utama bakteri adalah untuk mengalami transformasi kemampuannya untuk mengambil materi genetik ekstraseluler yang tersedia dari lingkungan. Bakteri seperti itu dengan kemampuan ini dikenal sebagai sel kompeten. Sel-sel kompeten ini juga merespons perubahan lingkungan dan mengambil gen melalui proses transformasi alami.

Tetapi tidak semua sel bakteri yang kompeten mampu mengambil DNA dari lingkungan. Itu harus kompeten secara artifisial dengan penggunaan bahan kimia atau pulsa listrik. Bahan kimia seperti kalsium fosfat digunakan dengan perlakuan kejut panas yang menyebabkan DNA masuk ke dalam sel. Metode pulsa listrik seperti elektroporasi membuat sel bakteri menjadi permeabel yang memungkinkan DNA masuk ke dalam sel.

Faktor-faktor yang mempengaruhi efisiensi transformasi:

  • Konsentrasi DNA (<10ng DNA digunakan untuk efikasi).
  • DNA superkoil lebih efisien daripada DNA linier
  • Konsentrasi garam yang tinggi menurunkan efisiensi transformasi selama elektroporasi.
  • Ligase harus diinaktivasi oleh panas karena menghambat elektroporasi sel.
  • Waktu antara transformasi dan pelapisan.
  • Media SOB paling cocok untuk transformasi.
  • Pembekuan dan pencairan sel menurunkan efisiensi transformasi.

Empat langkah yang terlibat selama transformasi bakteri:

  1. Persiapan sel yang kompeten
  2. Transformasi
  3. Masa pemulihan sel
  4. Pelapisan sel

Persiapan sel kompeten:

  • Sel-sel yang kompeten harus disiapkan dan E. coli adalah spesies bakteri yang paling umum digunakan.
  • Kompetensi dari E. coli sangat rendah, oleh karena itu; penggunaan bahan kimia atau elektroporasi harus diberikan ke sel untuk membuatnya kompeten.
  • Penggunaan bahan kimia seperti kalsium fosfat atau kalsium klorida ditambahkan dengan sel dan didinginkan untuk membuat sel-permeabel dan diinkubasi dengan DNA eksternal.
  • Perlakuan heat shock diberikan pada suhu 42°C selama 60 sampai 120 detik yang membuka membran sel dan menyebabkan DNA masuk ke dalam sel.
  • Perlakuan heat shock harus diberikan pada saat sel berada pada fase log pertumbuhan.
  • Selama elektroporasi, sel yang dipanen dicuci dengan air deionisasi dingin berulang kali untuk menghilangkan garam dan komponen lainnya. Kemudian garam akhirnya dipelet dan disuspensikan dalam gliserol 10%.

Transformasi:

  • Transformasi bakteri dilakukan dengan dua cara: Transformasi kimia dan elektroporasi sel kompeten.
  • Pilihan metode tergantung pada efisiensi transformasi dan sumber daya yang tersedia.
  • Sel-sel yang kompeten harus dicairkan di atas es dan sel-sel harus dicampur dengan lembut dengan mengocok dan mengetuk sebelum transformasi.
  • Perlakuan kejut panas juga dilakukan pada suhu 37 hingga 42°C selama 25 hingga 45 detik,
  • Sel yang diberi kejut panas ditempatkan di atas es selama kurang dari 2 menit sebelum melakukan langkah berikutnya.
  • Elektroporasi sel dilakukan dengan menggunakan elektroporator di mana sel kompeten dan DNA terkena medan listrik tegangan tinggi yang membuka pori-pori membran sel dan DNA masuk ke dalam sel.

Periode pemulihan sel:

  • Sel-sel setelah kejutan panas atau elektroporasi dikultur dalam media cair bebas antibiotik untuk memungkinkan ekspresi gen antibiotik untuk waktu yang singkat.
  • Untuk pemulihan sel, sel-sel yang diubah dikultur dalam 1ml media SOC dan diinkubasi pada 37°C.
  • Medium SOC mengandung glukosa dan MgCl2 yang meningkatkan efisiensi transformasi.

Pelapisan sel:

  • Sel-sel dilapisi pada agar LB bersama dengan antibiotik dan agen lain untuk identifikasi dan pemulihan transforman.
  • Jika skrining biru atau putih dilakukan, X-Gal dan IPTG harus dimasukkan dalam pelat agar.
  • Pelat harus dipanaskan terlebih dahulu sebelum pelapisan sel untuk mempertahankan suhu pertumbuhan yang menguntungkan dan untuk mencegah kontaminasi dan koloni campuran.
  • Setelah pelapisan sel, ia harus menghasilkan jumlah individu yang cukup, koloni yang berbeda untuk penyaringan lebih lanjut.

Perhitungan efisiensi transformasi:

Koloni perlu disaring lebih lanjut untuk mendeteksi adanya plasmid yang diinginkan atau tidak. Setelah konformasi, koloni digunakan dalam aplikasi hilir seperti isolasi plasmid, sub-kloning, transfeksi dan ekspresi protein.

Referensi:

  1. https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/transformation.html#:~:text=Bacterial%20transformation%20is%20a%20process,Avery%20et%20al%20in%201944.
  2. https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/
  3. https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/bacterial-transformation-selection
  4. https://microbenotes.com/bacterial-transformation/
  5. https://www.thermofisher.com/np/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/molecular-cloning/transformation/bacterial-transformation-workflow. html
Leave A Reply

Your email address will not be published.